Nowoczesna ultrawirówka analityczna: rozdzielczość, detekcja wielofalowa i analiza złożonych kompleksów W roku 2026 mija 100 lat od przyznania T. Svedbergovi Nagrody Nobla za badania nad chemią koloidów oraz ponad 103 lata od wynalezienia przez niego i współpracowników wirówki analitycznej. Pomimo upływu czasu, metoda wirowania analitycznego (AUC - analytical ultracentrifugation) nadal pozostaje jedną z najważniejszych technik biofizycznych, chociaż jej główne założenia praktycznie nie zmieniły się od momentu powstania. W wielu badaniach uznawana jest za tzw. złoty standard i zalecana np. przez amerykańską Agencję Badania Żywności i Leków (FDA) do badania produktów farmaceutycznych, wektorów w terapiach genowych, przeciwciał monoklonalnych, badaniach agregacji leków, czy ostatnio w doskonaleniu szczepionek opartych o mRNA przeciw COVID-19 i wielu innych. Wirowanie analityczne odcisnęło swoje piętno w takich odkryciach jak np. replikacja DNA, badania kompleksów rybosomalnych czy podjednostek proteasomu. W ostatnich latach metoda ta przeżywa wyraźny renesans, głównie za sprawą ciągłego doskonalenia sprzętu oraz algorytmów i programów do analizy danych. Historia rozwoju instrumentu obejmuje kilka etapów, prawdziwych kamieni milowych. Pierwszy komercyjnie dostępny instrument Model E, opracowany w roku 1947, pomimo że znacznie mniejszy od oryginalnej wirówki Svedberga (zajmowała ona 2 piętra w budynku) nadal przypominał ogromną szafę i był stosunkowo trudny w obsłudze, co odstraszało potencjalnych użytkowników. Prawdziwym przełomem było wprowadzenie na rynek przez firmę Beckman, odpowiednio w roku 1992 i 1996, modeli Proteomelab XL-A and XL-I. Osiągnęły one wymiar standardowej wirówki preparatywnej i wyposażone były w komputerowy układ akwizycji danych, możliwość precyzyjnej regulacji szybkości rotora oraz temperatury. Dodatkowo model XL-I pozwalał na zbieranie danych nie tylko z wykorzystaniem absorbancji ale także interferencji. Następnym udoskonaleniem była możliwość zastosowania fluorescencyjnego systemu detekcji (modyfikacja T. Laue), co znacznie poszerzyło możliwości wirówki i zwiększyło jej selektywność i czułość. W roku 2017 Beckman-Coulter zaprezentował Optimę AUC, najbardziej zaawansowany technologicznie model wirówki. W stosunku do poprzednich instrumentów znacznie zwiększono rozdzielczość pomiaru, poprawiono stosunek sygnału do szumu, 11x zwiększono rozdzielczość optyki interferencyjnej oraz poprzez umożliwienie jednoczesnej detekcji sygnału w 20 różnych długościach fali zwiększono precyzję pomiaru złożonych kompleksów. Wszystko to w znacznie krótszym czasie niż w przypadku poprzednich modeli. Równolegle do rozwoju sprzętu obserwujemy doskonalenie metod analitycznych. Dostępnych jest kilka pakietów ciągle rozwijanego, bardzo zaawansowanego oprogramowania, takich jak: Sedfit/Sedphat (P. Schuck), UltraScan (B. Demeler), SedAnal (W. Stafford) czy DCDT+ (J.Philo). Oprogramowanie to jest bezpłatne a towarzyszy mu bardzo bogata literatura oraz instrukcje obsługi, filmy instruktażowe i lisy dyskusyjne. Podstawy teoretyczne AUC Zasady funkcjonowania wirówki analitycznej pozostają niezmienne od początku jej istnienia. Przy pomocy czułego systemu detekcji analizowany jest proces sedymentacji badanych próbek. Na cząsteczkę zanurzoną w buforze i poddaną oddziaływaniu sił grawitacyjnych działają trzy siły: siła odśrodkowa Fo, siła wyporu Fw oraz siła tarcia dynamicznego Ft. W krótkim czasie siły te równoważą się a cząsteczka porusza się ruchem jednostajnym Fo + Fw + Ft = 0, bądź jak w przypadku równowagi sedymentacji, pozostaje nieruchoma.Upraszczając wzór otrzymujemy definicję współczynnika sedymentacji s: ω - prędkość kątowaf - współczynnik tarciav - prędkość ruchu cząsteczkir - odległość cząsteczki od centrum obrotuρ - gęstość rozpuszczalnikaῡ - cząstkowa objętość właściwa M - masa molowa cząsteczkiN - liczba Avogadro Współczynnik ten wyrażony jest w sekundach. Na cześć odkrywcy metody, Thé Svedberga jednostką sedymentacji jest 1 Svedberg (S) = 10-13 sekundy. 2 zasadnicze typy doświadczeń wirowania Wirówka analityczna, dzięki zainstalowanym układom optycznych, pozwala na dynamiczne śledzenie zmian rozkładu stężeń roztworu badanej próbki umieszczonej w celce pomiarowej. Doświadczenie odbywa się w ściśle kontrolowanych warunkach: precyzyjnie wyznaczonej temperaturze oraz szybkości kątowej rotora. Wirówka XL-I może dysponować 3 systemami detekcji: absorpcyjnym UV/VIS i interferencyjnym oraz fluorescencyjnym. Analizowana próbka umieszczona jest w rotorze tytanowym i może być wirowana z prędkościami w zakresie od 1 000 do 60 000 obrotów na minutę, co pozwala na analizę obiektów o masie od 1000 Da do 1 500 000 Da – czyli od peptydów i fragmentów kwasów nukleinowych do złożonych kompleksów makrocząsteczek czy wirusów.Badana próbka znajduje się w aluminiowej celce analitycznej zaopatrzonej w szafirowe lub kwarcowe okna oraz wymienny element centralny. Na wyposażeniu wirówki znajdują się m.in. następujące elementy: dwukomorowy i sześciokomorowy, zbudowane z epoksydu, dwukomorowy aluminiowy (do rozpuszczalników organicznych) oraz epoksydowy o skróconej drodze optycznej (3mm) do badania próbek w dużych stężeniach lub o dużej absorpcji. Przewaga wirowania analitycznego nad innymi podobnymi technikami analizy biofizycznej.W ostatnim czasie pojawiło się wiele technik, które próbują konkurować z wirowaniem analitycznym. Żadna inna metoda analityczna nie jest jednak tak uniwersalna i tak udokumentowana jak AUC. Metoda ta pozwala bowiem na analizę szerokiej gamy makromolekuł w ich natywnym stanie (bez znakowania, w różnych stężeniach), optymalnym środowisku (pH i siła jonowa buforu), bez udziału wypełnienia kolumn oddziaływującego z analitem, zewnętrznych standardów, czy skomplikowanej kalibracji. Może analizować takie próbki jak: białka, peptydy, kwasy nukleinowe, przeciwciała, cząsteczki lipidowe, liposomy, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, micele, polimery, koloidy, nanocząsteczki, wektory wirusowe i wiele innych. Jest to także technika niedestrukcyjna, tak więc analizowane próbki mogą być następnie wykorzystane do dalszych badań lub poddane np. krystalizacji. Żadna inna technika nie dostarcza tak różnorodnych danych, uzyskanych w jednym doświadczeniu jak np. współczynnik sedymentacji i dyfuzji, stechiometrii reakcji, stanu homo, hetero-oligomeryzacji, jednorodności, wzajemnych oddziaływań poszczególnych komponentów, agregacji, czystości, masy, kształtu, średnicy czy stabilności.
Rosnąca zdolność szczepionek do wpływania na jakość życia generuje popyt na opracowywanie coraz lepszych preparatów — od nowych terapii przeciwnowotworowych i szczepionek przeciw grypie sezonowej, po ochronę przed zagrożeniami bioterroryzmu i nowo pojawiającymi się chorobami. Firma Beckman Coulter oferuje pełną gamę rozwiązań opartych na technologii wirowania, wspierających procesy opracowywania i wytwarzania szczepionek. Od wstępnego klarowania komórek, przez oczyszczanie lub rozdzielanie inaktywowanych wirusów — Beckman Coulter dostarcza idealne wirówki dla każdego laboratorium. Ponad siedem dekad doświadczenia pozwoliło Beckman Coulter stworzyć kompleksową ofertę wirówek, które łączą szybkość działania z najwyższą jakością separacji. Niezależnie od tego, czy przedmiotem prac są szczepionki wirusowe, bakteryjne czy komórkowe, technologie wirowania firmy Beckman Coulter przyspieszają procesy, zwiększają wydajność i pomagają osiągać ambitne cele w zakresie badań i rozwoju oraz w przebiegu samej produkcji.
Hodowla komórek eukariotycznych, roślinnych, czy drożdży, odgrywa kluczową rolę w badaniach naukowych oraz zastosowaniach przemysłowych. Od podstawowych badań nad wzrostem i różnicowaniem po wielkoskalową produkcję cennych metabolitów lub białek stosowanych w terapiach, hodowle wymagają precyzyjnego monitorowania i optymalizacji. Niniejszy artykuł ilustruje, w jaki sposób mikrobioreaktor BioLector XT i licznik Coultera Multisizer 4e zapewniają skuteczne narzędzia do optymalizacji warunków hodowli i poprawy wzrostu komórek różnych organizmów.
Laboratorium aplikacyjne ITS SCIENCE. Saccharomyces cerevisiae to organizmy jednokomórkowe, składają się z pojedynczych komórek wielkości kilku mikrometrów. To drożdże znane głównie z ich zdolności do fermentacji - procesu, w którym przekształcają cukry w alkohol i dwutlenek węgla. Nazywane są często drożdżami piwowarskimi lub chlebowymi, ponieważ ten gatunek drożdży od wieków jest wykorzystywany przez ludzi do wytwarzania piwa, wina i pieczywa. Ich zdolność do fermentacji jest również wykorzystywana w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym. Te drożdże są także popularnym modelem w badaniach naukowych, szczególnie w biologii komórkowej i genetyce. Ich prosty cykl życia oraz oraz fakt, że są organizmami eukariotycznymi, czynią je użytecznymi dla naukowców do zrozumienia podstawowych procesów biologicznych.
Strona 1 z 2
Please wait...